Echtzeitkeimzählung in Pharmawasser

On-line Überwachung von mikro­biellen Verun­reini­gun­gen in phar­mazeutis­chen Wasser­sys­te­men bietet ein großes Poten­tial zur sig­nifikan­ten Verbesserung sowohl bezüglich der Kon­trolle der Keim­be­las­tung in Wasser­an­la­gen als auch in Bezug auf den nöti­gen Energieaufwand zum Erhalt der Keimfreiheit.

Wasser als Ressource in der Pharmaproduktion

Wass­er ist die wohl essen­tiell­ste und sen­si­bel­ste Ressource in der phar­mazeutis­chen Pro­duk­tion. Klas­sis­che mikro­bi­ol­o­gis­che Meth­o­d­en (kul­tur­ab­hängige Meth­o­d­en) dienen seit jeher zur Kon­trolle über den Keimge­halt der Ressource Wass­er. Die Ergeb­nisse dieser Lab­o­r­analy­sen wer­den in KBE (Koloniebilden­den Ein­heit­en) aus­gewiesen und besitzen nach­weis­lich und wissentlich einen großen Man­gel an Sen­si­tiv­ität, Kon­ti­nu­ität und zeit­na­hem Infor­ma­tion­ser­halt; ein zeitlich­er Verzug von bis zu ein­er Woche bis zum Ergeb­nis­er­halt liegt in der Natur der Meth­ode. Die darüber hin­aus nur stich­probe­nar­tig möglichen Probe­nah­men von sehr kleinen Akquisen an den rel­e­van­ten Probeent­nahmestellen stellen eine weit­ere Lim­i­tierung bezüglich des Infor­ma­tion­ser­halts über den Keim­be­las­tungszu­s­tand im Wass­er dar. In Folge dieser man­gel­nden Prozesskon­trolle wird ver­sucht phar­mazeutis­che Wasser­sys­teme durch Erhitzung oder dauer­hafte Heißhal­tung auf ca. 90°C und durch den Ein­satz von Chemie dauer­haft keim­frei, bzw. unter Kon­trolle, zu halten.

Die Echtzeitkeimzäh­lung auf der Basis der laserinduzierten Flu­o­reszenz (LIF) in phar­mazeutis­chen Wasser­an­la­gen bietet hier ein großes Poten­tial zur sig­nifikan­ten Verbesserung sowohl bezüglich der Kon­trolle über den mikro­biellen Zus­tand der Wasser­sys­teme als auch in Bezug auf den nöti­gen Energieaufwand zum Erhalt der Keim­frei­heit. Durch kon­tinuier­liche Beprobung und somit dem Erhalt von steti­gen Online-Dat­en kann jegliche Entar­tung (ansteigende Verkeimung, Abrisse von Biofil­men, Fil­ter­ef­fizienz und ‑durch­brüche) des Wasser­an­la­gen-Sys­tems rechtzeit­ig erkan­nt und entsprechend sofort ziel­gerichtet und effizient gegenges­teuert werden.

Das Problem mit der Aussagekraft der klassischen mikrobiologischen Methoden

Die derzeit­ige akzep­tierte und haupt­säch­lich prak­tizierte Meth­ode um die Qual­ität des Wassers in Bezug auf Keimge­halt zu über­prüfen, ist die klas­sis­che wach­s­tums­basierende Meth­ode. Hier­für wer­den Ent­nah­men einzel­ner Proben an sig­nifikan­ten Probe­nahmestellen — den soge­nan­nten point-of-use (POU) – vol­l­zo­gen. Mit den Ergeb­nis­sen nach Inku­ba­tion und Auszäh­lung der KBE wird ver­sucht die Kon­trolle über ganze Wasser­sys­teme zu erlan­gen. Durch den enor­men Aufwand dieser Prax­is sind peri­odis­che Über­prü­fun­gen ein und des­sel­ben POU häu­fig nur in größeren Inter­vallen möglich. Ergeb­nisse erlauben nur ret­ro­spek­tive Bew­er­tun­gen der Wasserqual­ität (bis zu ein­er Woche nach Ent­nahme der Probe). Eine zeit­na­he Risikobe­w­er­tung — ganz zu schweigen von ein­er kon­tinuier­lichen Prozesskon­trolle- ist so nahezu unmöglich. Auf­grund der wohlbekan­nten fehlen­den Sen­si­tiv­ität der klas­sis­chen wach­s­tums­basieren­den Meth­ode sind falsch-neg­a­tive Ergeb­nisse zu erwarten; es wächst eben nach­weis­lich nur ein klein­er Anteil der sich im Wass­er befind­lichen Keime auf den einge­set­zten Agar-Kom­plexnährme­di­en. Des Weit­eren kann das man­gel­nde Nährstof­fange­bot in phar­mazeutis­chen Wasser­sys­te­men zum extremen Schrumpfen der Keime führen, und auch physikalis­ch­er und chemis­ch­er Dauer­stress ein Her­anwach­sen zu KBE im Labor ver­hin­dern; man spricht hier von den soge­nan­nten VBNC (viable but not cul­tur­able). Mögliche falsch-pos­i­tive Ein­träge sind auf der anderen Seite durch die vie­len händis­chen Ein­griffe von den Probe­nah­men bis hin zum durchge­führten Auss­pateln des Probe­naliquots im Labor möglich.

Vorteile durch Verwendung eines Echtzeitkeimzählers auf LIF Basis

Energieef­fizienz

• Reduk­tion von Sanatisierungs Zyklen und Chemieeinsatz
• Reduk­tion der Tem­per­atur von Heißwasser­sys­te­men und/oder Reduk­tion der Aufheizzyklen.

Lab­o­raufwand

• Ver­min­derte Fre­quenz der Probe­nahme und des klas­sis­chen mikro­bi­ol­o­gis­chen Lab­o­raufwands durch kon­tinuier­lich­es Online Mon­i­tor­ing und Optimierung

Pro­duk­tqual­ität und Prozesskontrolle

• Verbesserte Reak­tions­fähigkeit auf mikro­bielle Entartungen
• Echtzeit­freiga­be von wäss­ri­gen Prozessmedien
• Höheres Prozessver­ständ­nis und Prozesskontrolle

Laser induzierte Flu­o­reszenz (LIF) – physikalis­che Basis der Meth­ode Echtzeitkeimzählung
Die Echtzeitkeimzäh­lung bedi­ent sich der hochsen­si­tiv­en, spek­troskopis­chen Meth­ode der Laser induzierten Flu­o­reszenz (LIF). Durch Ein­satz eines Lasers wer­den Metabo­lite des Zell­stof­fwech­sels in Keimen zur Flu­o­reszenz angeregt. Man spricht hier von der Erzeu­gung intrin­sis­ch­er Flu­o­reszenz; im Gegen­satz zu ver­wandten Labormeth­o­d­en, welche eben­falls zu den LIF´s gehören, aber der Beiga­be und Markierung der Zellen mit Flu­o­rophoren bedür­fen um eine Flu­o­reszen­zant­wort zu erhal­ten (Durch­flusszy­tome­trie) oder einen Inku­ba­tion­ss­chritt erfordern um eine aus­re­ichende Menge an intrin­sis­ch­er Flu­o­reszenz zu erhal­ten (Groth-based auto Flu­o­reszenz Meth­o­d­en). Der Ein­satz von hoch­en­er­getis­chen Lasern (405nm) zur Anre­gung macht eine Detek­tion von ger­ing­sten Men­gen an intrin­sis­ch­er Flu­o­reszenz möglich, ohne vorherge­hende Proben­vor­bere­itun­gen wie Fär­bun­gen und Inku­ba­tion­ss­chritte. Typ­is­che Zell­metabo­lite die durch LIF eine Anre­gung erfahren sind Tryp­to­phan, NADH, und Flavine. Die Anre­gungswellen­länge von 405nm ist zugle­ich abges­timmt auf die Anre­gungsspek­tren dieser Ziel­metabo­lite, wodurch eine hohe Anzahl von nicht biol­o­gis­chem Mate­r­i­al von der Anre­gung aus­geschlossen wer­den kann. Den­noch gibt es eine Rei­he an nicht biol­o­gis­chen Stof­fen wie Gum­mi, Plas­tiken und Cel­lu­lose die eben­falls in diesem Spek­trum flu­o­reszieren. Diese gilt es durch Diskri­m­inierung mit­tels Soft­ware Algo­rith­men und geeignetem Detek­tor Design effizient auszublenden.

Der IMD‑W Echtzeitkeimzähler (OWBA) – das richtige Detektor- und Software-Design

Der IMD‑W Echtzeitkeimzäh­ler für Wass­er auf LIF Basis ermöglicht die sofor­tige Detek­tion von Keimen (in Echtzeit); man spricht auch von Online Water Biobur­den Ana­lyz­er (OWBA). Der Ein­satz von Ver­brauchs­ma­te­ri­alien und die Lim­i­tierun­gen der klas­sis­chen mikro­bi­ol­o­gis­chen Meth­o­d­en, wie zuvor erwäh­nt, ent­fall­en. Der OWBA nutzt einen Laser bei 405nm Wellen­länge für die Anre­gung der intrin­sis­chen Flu­o­reszenz und zur Erzeu­gung von MIE Streulicht gle­ichzeit­ig. Zur Detek­tion der Sig­nale wer­den eine Pho­to­di­ode- zur Bew­er­tung des MIE Streulichtsig­nals- und zwei Pho­to­mul­ti­pli­er (PMT) bei unter­schiedlichen Detek­tions­bere­ichen zur Detek­tion der Flu­o­reszen­zant­worten einge­set­zt. Über diese drei Sig­nale (Pho­to­di­ode, PMT‑1, PMT‑2), und deren Auswer­tung über geset­zte Algo­rith­men, erfol­gt eine sehr effiziente Diskri­m­inierung zwis­chen inerten Par­tikeln und Keimen. Über die MIE Streulicht Detek­tion kön­nen Aus­sagen über die Größe der Partikel/Keime getrof­fen wer­den. Sys­teme die nur einen PMT besitzen kön­nen diese effiziente Diskri­m­inierung zwis­chen Keim und Inter­fer­enten (Eli­m­inierung von falsch pos­i­tiv­en Befun­den) nicht gle­icher­maßen leisten.

Ein weit­er­er wichtiger Aspekt in Bezug auf die mikri­bielle Überwachung ist die Überwachung und Kon­trolle von Ster­il­fil­tern in Wasser­sys­te­men. Keime in phar­mazeutis­chen Wasser­sys­te­men haben oft­mals, auf­grund des man­gel­nden Nährstof­fange­bots, die Ten­denz zu stark zu schrumpfen, wom­it sie in der Lage wären einen 0,2µm Ster­il­fil­ter zu passieren. Daher ist es für die absolute Prozesskon­trolle der Wasser­sys­teme und das Mon­i­tor­ing der Leis­tung von Ster­il­fil­tern essen­tiell einen OWBA mit entsprechen­der Sen­si­tiv­ität einzuset­zen. Die Detek­tion von Par­tikeln und Keimen ab 0,2µm muss möglich sein.

Zusammenfassung

Sowohl die reg­u­la­torischen Anforderun­gen als auch die phar­mazeutis­che Indus­trie selb­st forcieren und anerken­nen die Notwendigkeit von besseren Analy­sesys­te­men um die Keim­be­las­tung in phar­mazeutis­chen Wasser­sys­te­men zu überwachen. LIF basierende Echtzeitkeimzäh­ler für Wass­er wie der IMD‑W ermöglichen eine Überwachung der Keim­be­las­tung kon­tinuier­lich und eben in Echtzeit. Über diese stetige online Überwachung kön­nen lück­en­lose, aus­sagekräftige, his­torische Daten­sätze zum „Trend­ing“ und zur exak­ten Bew­er­tung der Keim­be­las­tung in Wasser­sys­te­men herange­zo­gen wer­den. Die Prozesskon­trolle und damit die Reak­tions­fähigkeit auf Sys­te­men­tar­tun­gen (Über­schre­itung von Gren­zw­erten), kann durch die kon­tinuier­liche Echtzeitüberwachung in Wass­er extrem gesteigert wer­den. Hier­aus ergeben sich weit­er­hin ein höheres Maß an Prozessver­ständ­nis, eine verbesserte Pro­duk­tqual­ität, Risiko­re­duk­tion und Einspar­po­ten­tiale beim Energieverbrauch.