Untersuchung von Biomolekülen und Zellen

JPK Instru­ments, ein weltweit führen­der Her­steller von Nanoan­a­lytik-Instru­menten für den “Life Sci­ences”- und “Soft Matter”-Bereich, berichtet über den Ein­satz der ForceR­o­bot- und NanoWiz­ard-Rasterkraft­mikroskop-Sys­teme (engl. Atom­ic Force Micro­scope – AFM) in der Gruppe von Prof. Sklá­dal an der Masaryk-Uni­ver­sität in Brünn, Tschechien. Die Gruppe unter­sucht Bio­moleküle und Zellen, um neue Biosen­soren zu entwickeln.

Dr. Jan Pribyl ist stel­lvertre­tender Leit­er der Gruppe von Prof. Petr Sklá­dal an der Masaryk-Uni­ver­sität in Brünn, Tschechien. Das Hauptziel der Gruppe war, elek­tro­chemis­che und akustis­che (QCM) Biosen­soren zu entwick­eln. Daraus resul­tierte die Idee, Rasterkraft­mikroskopie einzuset­zen und mit dieser hochau­flösenden Meth­ode Bio­moleküle, Nanopar­tikel und/oder andere nanos­truk­turi­erte Objek­te auf der Ober­fläche von fes­ten, nicht-trans­par­enten Biosen­sor-Trans­duc­ern (Elek­tro­den) abzu­bilden. Dieses Pro­jekt startete vor neun Jahren, aber der entschei­dende Schritt nach vorne gelang erst 2014 mit der Anschaf­fung der JPK ForceR­o­bot- und NanoWiz­ard-AFM-Sys­teme. Bei­de ste­hen in der Nanobio Core Facil­i­ty des CEITEC und wer­den nun seit über drei Jahren inten­siv genutzt. Die aus­gek­lügel­ten Sys­teme kön­nen mit invers­er Licht­mikrokopie kom­biniert wer­den und ermöglichen sog. Force-Map­ping (die Auf­nahme von Kraftkur­ven), so dass die Gruppe inten­siv mit der Forschung an leben­den Zel­lkul­turen begin­nen kon­nte. Der entschei­dende Unter­schied der JPK-Sys­teme im Ver­gle­ich zu anderen Rasterkraft­mikroskopen im Labor war, dass mit ihnen prob­lem­los biol­o­gis­che Proben in Flüs­sigkeit­en unter­suchen konnten.

Bis jet­zt wur­den ver­schieden­ste Probe­narten unter­sucht, darunter Kar­diomy­ozyten, bei denen bio­mech­anis­che Eigen­schaften wie Kraft und Schla­grate mit dem Rasterkraft­mikroskop ein­fach aufgenom­men wer­den kön­nen, wenn ein entsprechend kalib­ri­ert­er Can­tilever auf der Ober­fläche des Kar­diomy­ozyten-Clus­ters ver­wen­det wird. Der Clus­ter kann in ein­er Stan­dard-Petrischale in dem eigens dafür konzip­ierten JPK PetriDish­Heater™ gehal­ten wer­den. Der Inhalt der Petrischale kann über inte­gri­erte Schläuche aus­ge­tauscht wer­den, so dass gelöste Medika­mente und ihr Ein­fluss auf z.B. bio­mech­anis­che Eigen­schaften von unter­schiedlichen Kar­diomy­ozyten-Arten unter­sucht wer­den können.

Ein weit­er­er Proben­satz war CAL51, eine Brustkreb­szel­len­lin­ie. Die Hip­po-Effek­toren YAP/TAZ agieren als mechanosen­si­tive Ein/Aus-Schal­ter, indem sie Änderun­gen in der Zusam­menset­zung und Mechanik der extrazel­lulären Matrix (ECM) wahrnehmen. Die Gruppe set­zte AFM und Nanoin­den­ta­tion ein, um Änderun­gen der Zell­steifigkeit zu beobacht­en, wenn die Aktiv­ität dieser Schal­ter beein­trächtigt war.

Der Ein­fluß der mech­a­nis­chen Eigen­schaften von Hil­f­s­ma­te­ri­alien auf die Steifigkeit von Fibrob­las­ten, die auf ein­er solchen Ober­fläche gewach­sen sind, wurde unter­sucht. Gle­ichzeit­ig wur­den andere Para­me­ter wie Zell­mor­pholo­gie und Akt­in­faser­struk­tur aufgenom­men. Auch die mech­a­nis­chen Eigen­schaften von jun­gen Pflanzen im Hypokotyl- und Wurzel-bere­ich wur­den unter­sucht, um die Unter­schiede zwis­chen ver­schiede­nen Muta­tio­nen aufzuzeigen. Die Exper­i­mente wur­den an leben­den Pflanzenor­gan­is­men nahezu unter Invi­vo-Bedin­gun­gen aus­ge­führt. Die Ergeb­nisse dieser und ander­er Exper­i­mente wur­den bere­its zusam­mengeschrieben und veröf­fentlicht (siehe Pub­lika­tio­nen am Ende des Artikels).

Dr. Pribyl sieht viele gute Gründe, die für das NanoWiz­ard AFM sprechen: “An erster Stelle muss die Kom­bi­na­tion mit Licht/Fluoreszenzmikroskopie erwäh­nt wer­den. Wir set­zen das JPK AFM-Sys­tem meis­tens für die Arbeit mit leben­den Zellen ein, wo das optis­che Bild essen­tiell ist. Flu­o­reszenz-Emis­sion wird aufgenom­men, wenn Zellen mit exprim­ierten YFP/GFP-Pro­teinen lokalisiert wer­den. Wir erweit­ern unser Olym­pus-Mikroskop ger­ade mit ein­er Zyla sCMOS-Kam­era von Andor. Die Kam­era kann direkt über die JPK-Soft­ware mit dem Sys­tem ver­bun­den wer­den, so dass optis­ches Bild und AFM-Mes­sung übere­inan­dergelegt wer­den kön­nen. Das eröffnet uns neue Möglichkeit­en in der Zell­forschung.” Als weit­eren wichti­gen Vorteil sieht er u.a. die Robus­theit des Sys­tems, das einen Durch­satz von mehreren hun­dert Zellen im Jahr bewälti­gen muss.

Für Dr. Pribyl ist JPKs QI-Mode (Quan­ti­ta­tive Imag­ing) mehr als nur ein quan­ti­ta­tiv­er Ansatz zur Date­nauf­nahme: “Ich per­sön­lich schätze die Präzi­sion, mit der die Spitze an jedem Punkt der aufzunehmenden Stelle in Kon­takt mit der Probe gebracht wer­den kann und mit der während der kurzen Zeit, die die Auf­nahme der Kraft-Abstand­skurve dauert, die Kraft kon­stant gehal­ten wird. Das ist bei sog. “prob­lema­tis­chen” Proben wie z.B. elastis­che Mate­ri­alien (Zellen, Hydro­gele, etc.) beson­ders nüt­zlich, die man mit den gängi­gen Modi wie Con­tact- oder AC-Modus nicht so ein­fach abbilden kann.”